BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Bakteri patogen merupakan salah satu agen potensial penyebab infeksi penyakit, karena memiliki kemampuan mengeluarkan toksin atau enzim yang secara fisik merusak fungsi sel (Bonang, 1997). Penyakit akibat infeksi bakteri patogen dapat menyebabkan kematian. Berdasarkan laporan WHO, sekitar 17 juta orang meninggal setiap tahun akibat infeksi bakteri (Haug, 2008). Di Indonesia, Staphylococcus aureus dan Klebsiella pneumonia menyebabkan infeksi dengan tingkat kematian masing-masing mencapai 63% dan 50% (Martono, 2007). Selain itu, Salmonella thypi menyebabkan lebih dari 47.500 kasus tifus setiap tahun dan data terbaru menyebutkan, penyakit diare dan pneumonia menduduki urutan teratas penyebab kematian pada anak-anak (Unjianto, 2008). Tingginya bahaya infeksi bakteri menyebabkan perlunya pengobatan yang lebih efektif dan aman.
Tumbuhan obat di Indonesia jumlahnya cukup melimpah, hanya sebagian kecil yang telah diteliti orang, namun sudah banyak yang digunakan dalam pengobatan tradisional. Oleh karena data ilmiah tumbuhan obat tersebut belum diketahui dengan jelas serta efikasinya sebagai obat belum terbukti secara merata, maka hingga sekarang belum dapat diterima dalam pengobatan modern (Zubaidi, 1990 dalam Attamimi et al., 2001)
Penggunaan tumbuhan sebagai obat tradisional cukup banyak, hal ini terlihat dari peningkatan ekspor simplisia biofarmaka ke berbagai negara tujuan. Pada tahun 2001, total nilai dagang biofarmaka dunia mencapai US$ 45 milyar dan meningkat menjadi US$ 5 triliun pada tahun 2005, dimana konstribusi ekspor biofarmaka Indonesia baru sekitar 0,22 % saja (Pharmacy Business, 2007 dalam ulfa et al., 2007).
Peningkatan penggunaan fitofarmaka (obat herbal) oleh masyarakat karena konsep back to nature yang ditawarkan memberikan kesan aman dikonsumsi disamping harganya yang terjangkau dan khasiatnya diyakini ampuh sejak zaman nenek moyang (ulfa, 2007).
Salah satu tumbuhan obat tradisional yang sering digunakan masyarakat adalah brotowali (Tinospora crispa) termasuk ke dalam family Menispermaceae. Tumbuhan ini berasal dari Asia Tenggara, misalnya di Indo Cina, Semenanjung MeIayu, Filipina dan Indonesia (Jawa, BaIi, Ambon). Tumbuhan ini dapat tumbuh di daerah pantai sampai dengan ketinggian 1.000 meter di atas permukaan laut.
Brotowali secara tradisional banyak digunakan masyarakat, maka diduga brotowali dapat menghasilkan senyawa metabolit sekunder yang dapat digunakan sebagai material obat, khususnya sebagai antibiotik. Untuk itu perlu dilakukan penelitian lebih mendalam mengenai senyawa metabolit sekunder yang dikandung tanaman tersebut.
1.2 Rumusan Masalah
Hal yang menjadi rumusan masalah pada penelitian ini adalah:
1.2.1 Bagaimana potensi tamanam brotowali untuk dijadikan sebagai material simplisia obat antibiotik.
1.2.2 Adakah Senyawa golongan alkaloid yang terkandung dalam ekstrak brotowali yang dapat digunakan sebagai bahan baku simplisia obat antibiotik.
1.2.3 Bagaimana daya antibiotik senyawa alkaloid dari ektrak tanaman brotowali.
1.3 Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini sebagai berikut:
1.3.1 Untuk mengungkap potensi tanaman asli yang berkhasiat obat tradisional sebagai material sintesis obat modern, khususnya antibiotik.
1.3.2 Ingin mengetahui kandungan senyawa metabolit skunder golongan alkaloid yang dihasilkan tanaman brotowali yang berkhasiat obat antibiotik.
1.4 Manfaat Penelitian
Manfaat penelitian ini antara lain dapat berfungsi sebagai informasi awal tentang kandungan senyawa metabolit skunder dari tanaman brotowali yang memiliki potensi khasiat antibiotik, disamping itu juga menjadi dasar untuk penelitian selanjutnya mengenai pemanfaatan maupun sistesis obat dari tanaman brotowali (Tinospora crispa).
BAB II
KAJIAN PUSTAKA
2.1 Klasifikasi Brotowali (Tinospora crispa)
Gambar 1. Brotowali (Tinospora crispa)
Brotowali disebut Tinospora crispa (L.) Miers, atau Tinosporarumphii atau Tinosporatuberculata termasuk kedalam famili tumbuhan Menispermaceae (www.tanamanobat.com).
Berikut klasifikasi ilmiah tanaman brotowali:
Kingdom : Plantae
Divisio : Spermathophyta
Sub division : Angiospermae
Class : Dicotyledonae
Ordo : Euphorbiales
Family : Euphorbiaceae
Genus : Tinospora
Species : Tinospora crispa (L.) Miers (anonim, 2009)
2.2. Morfologi tanaman brotowali (Tinospora crispa)
Brotowali merupakan tumbuhan yang tumbuh liar di hutan, ladang atau kita juga bisa menanamnya. Brotowali sangat suka pada tempat yang panas, tumbuhan ini termasuk perdu dan memanjat. Memiliki tinggi batang hingga 2,5 m dengan besar batang sebesar jari kelingking, berbintil-bintil rapat dan memiliki rasa yang pahit. Tumbuhan ini juga merupakan tumbuhan daun tunggal, bertangkai, dengan bentuk daun seperti jantung atau agak mirip seperti bundar telur berujung lancip, dengan panjang daun 7-12 cm dan lebar 5-10 cm. Bunganya berukuran kecil, dengan warna hijau muda dengan bentuk tandan semu. Tumbuhan ini juga dapat diperbanyak dengan cara stek (www.hidupherbal.com).
2.3. Brotowali Sebagai Obat Tradisional
Tumbuhan brotowali (Tinospora crispa) telah lama digunakan untuk pengobatan. Kemudian diinformasikan bahwa ekstrak kasar tumbuhan ini berkhasiat sebagai antimalaria, antipiretika, antidiabetes, antiinflamasi dan analgetik (zambrut dkk, 2001)
Suatu suku di kalimantan, secara tradisional menggunakan Tinospora crispa untuk mengobati diabetes, hipertensi, dan sakit pinggang, di thailand secara tradisional digunakan dalam pengobatan tradisional, Tinospora crispa adalah salah satu komposisi dari obat rakyat thailand dalam mempertahankan kesehatan (Anthony C., Jean-Pierre Cavin, 2009)
2.3 Alkaloid
Senyawa alkaloid adalah salah satu senyawa yang paling banyak ditemukan di alam. Hampir seluruh senyawa alkaloid berasal dari tumbuh-tumbuhan dan tersebar luar dalam berbagai jenis tumbuhan. Alkaloid adalah senyawa bahan alam yang mempunyai atom nitrogen yang bersifat basa pada strukturnya. Nama alkaloid diturunkan dari kata alkaline yeng mendeskripsikan berbagai nitrogen yang bersifat basa (sudarma, 2009).
Alkaloid sering kali beracun bagi manusia dengan bahaya yang mempunyai aktivitas fisiologi yang menonjol sehingga digunakan secara luas dalam pengobatan. Alkaloid biasanya tak berwarna, seringkali bersifat aktif optik kebanyakan berbentuk kristal pada suhu kamar. Prazat alkaloid yang paling umum adalah asam amino, meskipun sebenarnya biosintesis kebanyakan asam amino lebih rumit. Secara kimia alkaloid merupakan suatu golongan heterogen. Banyak alkaloid bersifat terpenoid dan beberapa diantaranya dari segi biosintesis merupakan terpenoid termodifikasi alkaloid lain terutama berupa senyawa atomatik dengan gugus basa sebagai rantai samping (Harborne, 1987)
2.3.1 Aktivitas Biologis Alkaloid
Alkaloid menghasilkan zat antimikrobial yang sangat signifikan pada Escherichia Coli, Staphylococus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia, prot eus vulgaris , Bacillus subtilis dan Candida Albicans (OKORO, Azubuike Gabriel, 1989). Beberapa senyawa alkaloid juga memiliki aktivitas anti kanker, yaitu alkaloid seperti vinblastine (VLB), vincristine (VCR), leurosine (LR), vincadioline, leurodisine, dan catharanthine. Alkaloid yang berefek menurunkan kadar gula, antara lain leurosine, catharanthine, lochnerine, tetrahydroalstonine, vindoline, dan vindolinine (http://jyotish-indonesia.com).
2.4 Pemisahan dengan Fraksinasi
2.4.1 Fraksinasi KLT
Khromatografi lapis tipis merupakan alat analisa yang cukup sederhana karena dapat menentukan jumlah komponen yang ada pada suatu bahan, bahkan dapat pula mengidentifikasi komponen-komponen tersebut. Disamping itu alat ini juga sangat ideal untuk memonitor progres suatu reaksi, untuk mengobservasi khromatografi kolom, untuk menentukan kemurnian hasil kristalisasi dan destilasi. (Sudarma, 2005).
Media pemisahannya adalah lapisan dengan ketebalan sekitar 0,1 sampai 0,3 mm zat padat absorben pada lempeng kaca, plastik, atau aluminium. Lempeng yang paling umum digunakan berukuran sekitar 8 x 2 inci. Dan zat padat yang umum digunakan adalah alumina, gel silika dan selulosa (R.A. Day & Underwood, 1994).
2.4.2. Fraksinasi Kolom Kromatografi
Khromatografi kolom merupakan teknik untuk memisahkan zat zat dalam jumlah yang agak besar. Pemisahan ini didasarkan pada polaritas relatif dari suatu molekul. Gelas kolom diisi dengan bubuk material seperti silica gel atau alumina didalam pelarut organik. Zat yang akan dianalisa atau dipisahkan dilarutkan terlebih dahulu dan diaplikasikan pada permukaan silica gel dan eluen didrainasikan pada kom tersebut. Carian yang didrainasikan melalui kolom ini dikoleksi atau ditampung sebagai serial fraksi pada wadah yang berbeda. Pemberian eluen terus dilakukan sampai semua zat yang dipisahkan pada kolom terelusi oleh pelarut (sudarma, 2005)
Kecepatan zat zat yang dipisahkan terelusi pada kolom tergantung dari polaritas zat-zat tersebut, polaritas silika dan alumina, dan polaritas dari pelarut yang dipergunakan sebagai eluen. Zat-zat yang terikat kuat oleh alumina atau silika dengan sistem eluen yang tidak begitu polar akan memerlukan waktu yang cukup lama untuk mengelusinya, tapi sebaliknya kalau diberikan eluen yang agak polar maka waktu untuk mengelusinya akan semakin singkat. Zat-zat yang dipisahkan akan membentuk band atau gelombang pada kolom, beberapa gelombang ini ada yang nampak ada juga yang tidak. Gelombang-gelombang ini akan bergerak turun pada kolom bersamaan dengan turunnya solvent atau eluen (sudarma, 2005).
2.5. Tinjauan Tentang Beberapa Bakteri Patogen
2.5.1. Eschericia coli
Bakteri yang mendekati genus ini mempunyai ciri-ciri morfologi sebagai berikut: berbentuk batang pendek (kokobasil), gram negatif, tidak membentuk spora, bersifat anaerob fakultatif dan mempunyai flagela peritrik. Sel E. coli mempunyai ukuran panjang 2-6 µm dan lebar 1,1-1,5 µm tersusun tunggal, berpasangan dengan flagella peritrikus. E. Coli tumbuh pada suhu antara 10-40 oC, dengan suhu optimum 37 oC, pH optimum pertumbuhannya antara 7,0-7,5, pH minimum pada pH 9,0.
Escherichia coli (E. coli) adalah bakteri gram negatif yang umumnya ditemukan pada salauran pencernaan hewan, termasuk juga manusia. Penyebaran bakteri ini juga meliputi tanah dan air. Bakteri ini masuk kedalam anggota kelompok famili Enterobacteriaceae. E. coli dapat berkembang dan bertahan hidup pada kondisi ketersediaan oksigen maupun kekurangan oksigen (Madigan, et al., 2000).
Escherichia coli merupakan salah satu bakteri penyebab penyakit pada sapi selain itu bakteri ini dapat terbawa ke dalam daging segar dan mungkin bertahan selama proses pengolahan (Siagian, 2002).
2.5.2. Pseudomonas aeruginosa
Bakteri yang mendekati genus ini mempunyai ciri-ciri morfologi sebagai berikut: Gram negatif, dan terlihat sebagai bentuk tunggal, ganda dan kadang-kdang dalam rantai pendek, berbentuk batang, ukurannya 0,6 x 2 µm, motil, oksidase positif, tumbuh baik pada 37-42 oC. P. aeruginosa bersifat aerobik obligat, kadang memproduksi bau manis, beberapa galur menghemolisis darah. P. aeruginosa membentuk koloni bulat halus dengan warna fluoresen kehijauan. Juga sering memproduksi pigmen kebiruan dan tidak fluoresen. Juga dapat memproduksi berbagai kelompok koloni, memberikan kesan biakan campuran beberapa spesies bakteri (Jawetz, dkk., 2005).
Infeksi Pseudomonas yang serius sering terjadi di rumah sakit dan bakteri biasanya ditemukan di tempat yang lembab, seperti bak cuci dan wadah air kemih. Bahkan organisme ini ditemukan dalam cairan antiseptik tertentu.
Infeksi paling serius terjadi pada orang yang sistem kekebalannya terganggu, baik karena pengobatan maupun penyakit. Pseudomonas bisa menginfeksi darah, kulit, tulang, telinga, mata, saluran kemih, katup jantung dan paru-paru.
Luka bakar juga bisa terinfeksi oleh Pseudomonas, menyebabkan infeksi darah yang sering berakibat fatal (Anonim, 2004).
2.5.3. Stapylococcus aureus
Bakteri yang mendekati genus ini mempunyai ciri-ciri morfologi sebagai berikut: warna koloni putih susu atau agak krem, bentuk koloni bulat, tepian timbul, sel bentuk bola, diameter 0,5-1,5 µm, terjadi satu demi satu, berpasangan, dan dalam kelompok tidak teratur, Gram positif, tidak motil, katalase positif, oksidase negatif, metil red positif, tumbuh optimum pada suhu 30-37 oC dan umbuh baik pada NaCl 1-7% (Isrina et al., 2005).
Menurut Holt et al., (1994) dalam Isrina, et al., (2005), bakteri Staphylococcus sp. Gram positif, tidak berspora, tidak motil, fakultatif anaerob, kemoorganotrofik, dan metabolisme fermentatif. Koloni biasanya buram, bisa putih atau krem dan kadang-kadang kuning keorange-orangean. Bakteri ini katalase positif dan oksidase negatif, sering mengubah nitrat menjadi nitrit. Biasanya tumbuh dengan 10% NaCl. Sebagian besar terdapat pada kulit dan mukosa membran dari vertebrata berdarah panas. Akan tetapi sering diisolasi dari produk makanan, debu dan air. Beberapa spesies ada yang patogen pada manusia dan hewan.
Staphylococcus aureus merupakan bakteri penyebab utama mastitis pada sapi dan kejadian mastitis sering diasosiasikan dengan infeksi Staphylococcus aureus. Swart et al., (1984) dalam Isrina, et al., (2005) melaporkan bahwa Staphylococcus aureus merupakan patogen utama yang sering menyebabkan mastitis subklinis dan kronis. Agus, (1991) melaporkan bahwa diantara 56 ekor sapi perah di peternakan sapi perah Baturaden, 41 ekor (73,2%) menderita mastitis subklinis, dan 9,1% diantaranya disebabkan oleh Staphylococcus aureus.
2.5.4. Bacillus cereus
Bakteri yang mendekati genus ini mempunyai ciri-ciri morfologi sebagai berikut: warna koloni putih susu atau agak krem, bentuk koloni bulat dengan tepian keriput. Sel adalah bentuk batang dan lurus, berukuran 0,5-2,5 x 1,2-10 µm, dan sering tersusun dalam bentuk sepasang atau rantai, dengan ujung bundar atau empat persegi. Gram posiift, motil, katalase dan oksidase positif, metil red negatif, optimum pada suhu 30-37 oC dan tumbuh baik pada NaCl 1-3%. Bakteri ini memiliki endospora berbentuk oval, kadang-kadang bundar atau silinder dan sangat resisten pada kondisi yang tidak menguntungkan. Mereka tidak lebih dari satu spora per sel dan sporulasi tidak tahan pada udara terbuka. Bakteri ini bersifat aerobik atau fakultatif anaerobik. Kemampuan fisiologi beragam; sangat peka terhadap panas, pH dan salinitas; kemoorganotrof dengan metabolisme fermentasi (Feliatra, dkk., 2004).
B. Cerus merupakan penyebab penting dari infeksi mata, kreatitis berat, endoftalmitis, dan panoftalmitis, serta berhubungan dengan beberapa infeksi baik lokal maupun sistemik. Bakteri ini dapat tumbuh dalam makanan dan dapat menghasilkan enterotoksin yang menyebabkan keracunan makanan (Jawetz, dkk., 2005). Bahan pangan potensial terinfeksi B. cerus antara lain serealia, makanan kering, produk-produk susu, daging (Siagian, 2002).
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1. Jenis Penelitian
Penelitian ini bersifat eksploratif eksperimental, yaitu mengisolasi senyawa alkaloid dari tumbuhan brotowali (Tinospora crispa) anggota genus Euphorbiaceae berdasarkan pada sejumlah karakteristik morfologi tumbuhan tersebut. Dan menganalisa potensi senyawaan alkaloid pada tanaman brotowali (Tinospora crispa) sebagai bahan simplisisa berkhasiat obat.
3.2. Sampel Penelitian
Sampel dalam penelitian ini adalah bagian batang dari tumbuhan brotowali (Tinospora crispa) yang diperoleh desa batunyala. Sampel tumbuhan berupa batang sebanyak seratus gram (berat kering) yang sebelumnya dikeringkan dengan diangin-anginkan dan ditumbuk halus, baru kemudian diisolasi senyawa alkaloidnya
3.3. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kimia Dasar dan Laboratorium Mikrobiologi Fakultas MIPA Universitas Mataram. Penelitian ini dimulai pada bulan Agustus sampai dengan Desember 2009.
3.4. Teknik Pengumpulan Data
Pengumpulan data untuk penelitian ini berupa isolasi senyawa alkaloid dari tamnaman sampel, kemudian dianalisa potensi senyawaan tersebut untuk dijadikan obat antibiotik. Sedangkan pengumpulan data untuk uji antibakteri dilakukan dengan mengukur diameter zona hambatan yang terbentuk dari uji ekstrak tanaman brotowali terhadap beberapa bakteri patogen gram positif dan gram negatif.
3.5. Alat dan Bahan Penelitian
3.5.1. Alat-Alat Penelitian
Peralatan yang digunakan dalam penelitian kali ini adalah: corong pisah, chamber, plat klt, erlenmeyer, gelas ukur, pipet volum, gelas kimia, rotavor.
3.5.2. Bahan-Bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah simplisia batang tumbuhan brotowali (Tinospora crispa), DCM, etil asetat,plat KLT dan pereaksi Dragendroff.
3.6. Prosedur Penelitian
Penelitian terhadap tanaman brotowali (Tinospora crispa) meliputi: ekstraksi alkaloid, dan uji antibiotik senyawaan alkaloid dari tanaman brotowali.
3.6.1. Poses ekstraksi alkaloid
Sampel batang brotowali sebanyak 100 gram dipotong-potong dan dimaserasi dengan larutan 10% asam asam asetat dalam metanol sebanyak 400 ml selama 2 x 24 jam. Maserat yang didapatkan difiltrasi kemudian dipekatkan dengan rotavor. Setelah dipekatkan larutan dibasifikasi dengan larutan NaOH encer sampai kira-kira pH 9. Maserat yang sudah dibasifikasi dieksrtrak dengan n-heksan. Ekstrak kemudian dianalisis dengan KLT menggunakan pereaksi Dragendorff sebagai analisa awal adanya alkaloid. ekstrak yang didapatkan kemudian menjalani proses pemurnian. Metoda yang digunakan adalah kromatografi kolom dengan elusi landaian menggunakan sistem pelarut: heksana: DCM : EtAst (4:1). Fraksi-fraksi hasil pemisahan kolom dianalisa dengan KLT dengan pereaksi dragendrof sebagai indikator alkaloid. Fraksi-fraksi yang positif alkaloid di refraksinasi untuk mendapatkan senyawaan alkaloid yang lebih murni dengan pelarut yang digunakan adalah DCM : EtAst (19:1, 9:1). Dari proses ini fraksi-fraksi yang diperoleh kemudian dianalisis dengan metoda KLT yang sama. Senyawa alkaloid terdapat pada fraksi-fraksi ini disatukan, dipekatkan dan ditimbang, kemudian diuji daya antibiotiknya terhadap bakteri.
3.6.3. Uji antibiotik terhadap bakteri uji
Uji ini dilakukan dengan penanaman bakteri uji Eschericia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus dan Staphylococcus aureus pada cawan petri berbeda pada media MHA yang sudah memadat dengan metode sebar menggunakan alat kaca spreader. Kemudian bakteri uji diinkubasi selama 5-10 menit dalam inkubator. Setelah itu media diberi sumuran dengan diameter 0,7 mm dan dimasukkan ekstrak botowali sebanyak 50 µl, kemudian diinkubasikan pada suhu 30oC selama 24-48 jam. Masing-masing ekstrak yang terdapat zona jernih diukur diameternya hambatannya terhadap bakteri.
Daftar Pustaka
Adek Zambrut A*, Desy M. Gusmali*: M. Husni Mukhtar*, 2001, Aktivitas AntimalariaSenyawa Tinokrisposid secara in vivo, Pusat Penelitian dun Pengembangarz Fannasi, Badan Penelitian dun Pengembangan Kesehatan Departemen Kesehatan RI, Jakarta.
Anonim, 2004. Infeksi Pseudomonas. http//www.medicastore.com. Diakses tanggal 7 oktober 2007 pukul 15.33 Wita.
Anthony C. Dweck FLS FRSC FRSH Technical Editor and Jean-Pierre Cavin Managing Director E.U.K. Brotowali (Tinospora crispa) – a review
Bonang, G. 1997. Infeksi "Rumah Sakit" Mengancam Pasien. Didownload dari http://www.indomedia.com.Tanggal 5 September 2008, pukul 16.00 WITA.
Feliatra, Efendi, I., Suryadi, E., 2004. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Probiotik dari Ikan Kerapu Macan (Ephinephelus fuscogatus) dalam Upaya Efisiensi Pakan Ikan. Jurnal Natur Indonesia 6(2): 75-80 (2004). Diakses dari http://www.unri.ac.id/jurnal tanggal 23 Januari 2007
Harborne. I.B., 1987. "Metode Fitokimia" , terjemahan K. Radmawinata dan I. Soediso, penerbit ITB, Bandung,
http://www.tanaman-obat.com/index.php/gallery-tanaman-obat/73-b-r-o-t-o-w-a-l-i. Diakses tanggal 11 maret 2009. Pukul 07.48 wita.
http://www.succulent-plant.com/families/euphorbiaceae.html. diakses tanggal 11 Maret 2009. Pukul 07.48 wita.
http://jyotishindonesia.com/index.php?option=com_content&task=view&id=109 & Itemid = 119. Diakses tanggal 16 maret 2008. Pukul 21.00 wita
Isrina, S.O., Haryadi, M.W, Wibowo dan Khusnan, 2005. Karakterisasi Fenotipe Isolat Staphylococcus aureus dari Sampel Susu Sapi Perah Mastitis Subklinis. J. Sain Vet. Vol. 23 No. 2 Th. 2005.
Jawetz, E., J.C Melnick and E.A Adelberg, 2001. Mikrobiologi Kedokteran. Salemba Medika. Jakarta
Madigan, Michael T., John M. Martinko, and Jack Parker. Brock Biology of Micro-organisms, diakses dari. http://www.bookrags.com/ diakses tanggal 26 Januari 2007.
Okoro, Azubuike Gabriel, 1989, Extraction, Purification and Antimicrobial Activities of Quaternary Alkaloids of the Plant Sphenocentrum Jollyanum Pierre, University of Nigeria.
Siagian, Albiner, 2002. Mikroba Patogen Pada Makanan Dan Sumber Pencemarannya. Fakultas Kesehatan Masyarakat Universitas Sumatera Utara, http://library.usu.ac.id/modules diakses tanggal 10 Januari 09.30.
Sudarma, Made. 2005. Teknik-Teknik Dasar Khomatografi Untuk Mengisolasi Dan Menganalisa Senyawa Bahan Alam Dan Komersial. Mataram.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar